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Caco-2细胞技术硬人结直肠腺癌Caco-2

2018-12-26 03:18:04 151次浏览
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Caco-2细胞技术硬人结直肠腺癌Caco-2 "

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解冻细胞常见实验问题分析及推荐解决方法:

在解冻冻存细胞时,发现会出现存活率低、大量细胞碎片及生长缓慢等问题,究竟是什么原因导致,我们该怎么进行解决?以下是国内外细胞培养专家针对解冻细胞实验问题,总结的一些解决方案!

出现低存活率的可能原因及推荐解决方案如下:

1.解冻过程中细胞裂解

推荐的解决方案:可预期到一定量的细胞死亡,因此细胞的浓度应足够高,考虑到这一损失。起始浓度为1*10(6)至1*10(7)细胞/毫升。

2.解冻过程中的问题

推荐的解决方案:在-70℃至-80℃下保存冷冻的培养物,保存时间为1-5天,但这不是保存的首选方法。在37℃充分解冻后应立即开始培养。

3.对冷冻液过敏

推荐的解决方案:A.完全或部分更换培养基,减少培养基中冷冻液的量。在24小时后更换培养液体可全部去除冷冻液。B.留出更多时间供培养物恢复。有时细胞需要几周时间才能形成单层或密集的悬浮物,取决于冷冻时细胞的年龄或传代次数或在生长阶段中的位置。冷冻的最佳条件在对数期。

4.被冷冻的原种细胞的年龄或冷冻时培养物的年龄

推荐的解决方案:解冻最近冷冻的细胞。细胞处于冷冻状态的时间越长,存活率越低。检查冷冻细胞的时间和方法。在冷冻时细胞应处于对数期。

出现大量细胞碎片的可能原因及推荐解决方案如下:

1.冷冻时细胞密度过低:推荐的解决方案:缩短解冻过程中的时间。将细胞取出后,立即将冻存管浸入在37℃的水浴中,并震荡至全部融化,然后迅速地转移到预热的培养基中。

2.不适当的冷冻过程:推荐的解决方案:解冻不同冷冻室总的试管。确保在冻存过程中采用的适当的技术,并确保使用了适量和适合的冷冻液。

出现生长缓慢的可能原因及推荐解决方案如下:

1.培养瓶的大小:一般解决方案是一些细胞在培养基中倾向于维持一定的密度。将培养物转移到较小的培养瓶中,使细胞密度上升;如,根据培养基的体积,从T75培养瓶转移到2或3个T25培养瓶中。

2.细胞密度过低:通常解决方案是提高未来冷冻物种细胞的冻存密度,或使用较小的培养容器,或解冻多个试管来进行培养。" "

实验细胞培养基常见问题总结:

培养基是细胞培养中不可缺少的营养成分,但是最基础的培养基却给实验者带来了一系列的问题。别小看细胞培养,这里可蕴含着大大的学问。有时候细胞状态不好,接下来的一系列实验根本就没法做。影响细胞培养的因素很多,那就先从培养基开始说起。

培养基常见问题:

1.怎样查到一个特定细胞株的相关知识和培养条件?ATCC、DSMZ、ECACC、RIKEN、promocell、ScienCell、ECACC、JCRB、KCLB、Asterand、ICLC以及少数国内外著名大学细胞库收集了绝大多数细胞的详细资料。细胞数据库中有每一种细胞的详细描述,包括细胞的来源,培养和冻存条件,以及相关文献等资料。

2.液体培养基可以放-20℃保存吗?不可以!因为在-20℃下,培养基中的盐容易析出,培养基融化后,有的盐可能无法重新溶解,从而导致培养基渗透压降低,培养细胞时,细胞容易破裂而死亡。

3.自己新配制的液体培养基能保存多久?我们建议将新配制的培养基放置于4℃,避光保存尽量在一周内使用完毕。培养基越新鲜越好。

4.培养基中添加了血清和抗生素后,可长期保存吗?一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时,您应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。

5.培养基中是否须添加抗生素?除了特殊筛选系统外,一般正常培养状态下,培养基中不应添加任何抗生素。为防止细菌、真菌污染,可以加入青霉素-链霉素双抗溶液,其培养基中的终浓度为青霉素100U/ml,链霉素为100ug/ml。

6.为何培养基保存于4℃冰箱中,颜色会偏暗红色,且pH值越来越偏碱性?培养基保存于4℃冰箱中, 培养基内之CO2 会逐渐溢出,造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenol red) 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果, 将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时,可以通入无菌过滤之CO2,以调整pH值。

7.培养液pH是怎样影响细胞生长的?由于大多数细胞适宜PH值为7.2-7.4,偏离此范围对细胞将产生有害的影响。各种细胞对PH值要求也不完全相同,原代细胞培养一般对PH值变动耐受差,无限细胞系耐受力强。但总体来说,细胞耐酸性比耐碱性强一些,偏酸环境中更有利于细胞的生长。因此,配制培养用液时可把液体的PH值稍微调的偏酸一些。液体在经过0.1um或0.2um滤膜过滤时,PH值会向上浮动0.2左右。

8.培养液渗透压是怎样影响细胞生长的?当细胞内、外环境的分子浓度不同时就会产生渗透压。这种情况下,水分通过渗透流入或流出细胞,从而改变细胞的内环境。高渗透压迫使水分从细胞中扩散出来导致细胞收缩,这种情况会使DNA和蛋白遭到破坏,细胞周期停滞以及最终使细胞死亡;反之,低渗透压使水分流入细胞内,使细胞肿胀破裂。

9.为什么液体培养基1640有时候颜色发黄,是pH值不对吗?不是。因为配方原因,1640为碱酚红型,其中酚红的浓度只有DMEM的四分之一,所以是因为酚红浓度低,而非PH值低。

10.为什么有客户要求培养基中不含酚红?研究表明,酚红可以模拟固醇类激素的作用(特别是雌激素)。为避免固醇类反应,细胞培养,尤其是哺乳类细胞时,用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测,一些研究人员在做流式细胞检测时,不使用加酚红的培养基。" "

常见问题及解决方案:

1、培养瓶有破裂,培养液有漏液:细胞极大可能会污染,所以我们会及时安排帮老师解决。

2、 细胞漂浮:培养瓶不开封,瓶口酒精擦拭后平躺放置在培养箱。次日观察,如细胞大部分又贴回瓶底,表明细胞活力正常,剩余漂浮的细胞可以离心去掉,留10ml培养液培养观察,细胞生长至汇合度80%,进行消化传代;如细胞还是不贴壁,将细胞离心收集转到新培养瓶,原培养瓶加部分培养液继续培养,中间注意观察,我们的技术人员会一直指导,直到问题解决。

3、对于生长缓慢的贴壁细胞:可采用适当的提高培养基中血清浓度,或隔日换液的方法来保证细胞的状态和生长速度。

4、对于生长不均的贴壁细胞:在培养过程中若出现细胞分布明显不均时(即某一区域细胞已重叠生长,而旁边则为一块空白),此时可将细胞进行消化,重新打散,贴壁,加入新培养基进行培养。

复苏细胞注意事项:

1收到细胞后当天换液,全部更换成客户自己的新鲜培养基,放进培养箱,第二天再消化。

2边观察边消化,根据细胞的形态,终止消化时间,采取以半分钟间隔吹打细胞边缘,如可吹打下来,即终止消化。客户摸索比较好的消化时间。

3随细胞有一份细胞操作说明书,请客户仔细查看。

4记得加1%双抗,降低被污染的概率。另外尽早冻存留种,以备后用。

5售后时间为一周,仅限于细胞本身的质量问题,而因乙方自己不当操作(不规范操作,消化过度,不加双抗导致的污染等)导致的细胞问题不在售后范畴。

6收到细胞后,如细胞状态不佳,或培养中遇到问题,烦请当天尽快联系,以便处理。当天及时反馈细胞情况和细胞照片是售后处理重要的参考依据,请您务必重视。

7刚收到细胞时,胎牛血清可以用15%培养两三天,利于细胞尽快恢复状态,细胞状态稳定后,再调回10%即可。

(其中1,2条针对于贴壁细胞,悬浮细胞详情请见细胞操作说明书)"